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제품실험자료 – (주)생물나라

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브로콜리 dna 추출 실험

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브로콜리 DNA 추출실험 by 혜인 조

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  브로콜리 DNA 추출실험 by 혜인 조
  ② 브로콜리(or 바나나) 약 50g을 막자사발에 넣고 가위로 잘게 자른 후 막자로 아주 곱게 간다. (50g은 대략 주먹만한 브로콜리 절반에 해당한다.) ③ 실험 전에 바로 … …
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  ② 브로콜리(or 바나나) 약 50g을 막자사발에 넣고 가위로 잘게 자른 후 막자로 아주 곱게 간다. (50g은 대략 주먹만한 브로콜리 절반에 해당한다.) ③ 실험 전에 바로 …
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오디오스-브로콜리 DNA 추출 실험

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브로콜리 DNA추출 및 전기영동

Ⅰ. 실험목표

1) 브로콜리에서 genomic DNA를 뽑아낼 수 있다.

2) gel electrophoresis를 통해 DNA를 확인하는 방법을 배운다.

3) DNA 추출과 전기영동에 이용된 시약의 특성을 이해한다.

Ⅱ. 실험원리 및 개요

유전자에 대한 특성을 위해서는 1차적으로 클로닝 과정을 통해 특정 유전자를 확보하는 것이다. 유전자를 클로닝하기 위해서는 유전자를 운반할 vector 및 vector의 증폭에 이용될 숙주세포가 필요하다. vector에는 여러 종류가 있지만 매우 흔하게 이용하는 것이 plasmid이다. 플라스미드에 restriction enzyme과 DNA ligase를 이용하여 외부 DNA를 삽입한 후 숙주세포에 형질 전환 시켜 증폭하면 외부 DNA를 짧은 시간 내에 매우 많은 양을 얻을 수 있다.

제한효소는 세균바이러스의 증식을 막아주는 효소로 침입한 바이러스의 DNA를 절단하는 효소로 발견되어 바이러스의 증식을 제한(restriction)한다하여 이름이 붙혀졌다. 숙주 세포의 핵산 분해 효소 (제한효소)가 바이러스의 특정한 염기 배열을 인식하여 그 부위를 절단하여 바이러스의 게놈을 파괴한다. 제한효소는 특정한 염기 배열을 인식하여 그 염기 배열만을 절단하며 대략 4-8개의 염기 배열을 인식하여 절단하는 제한효소가 일반적인 실험에서 유용하게 쓰인다.

제한효소는 자신이 인식하는 염기 배열을 절단할 때 그림과 같이 돌출된 부분은 만들 수 있으며, 이들 돌출된 부분은 서로 상보적이기 때문에 다시 서로 수소결합을 통하여 결합하게 되며, 유전자 분리 및 재조합 DNA를 만드는데 이용되고 있다.

본 실험에서는 브로콜리에서 DNA를 추출해 보고, 전기영동실험을 통해 DNA를 확인해 보고자 한다.

Ⅲ. 실험재료

1) 실험 재료 : 브로콜리

2) 시약 : 99.9% Ethanol, 계면활성제, NaCl, 증류수, Premade Agarose gel, 0.5X TAE buffer, 6X Gel loading buffer, CarolinaBlu™ DNA Stain, Proteinase K

3) 기구 : 막자사발, 가위(or 칼), 나무젓가락, 페트리 접시, 100ml 비이커, 스텐레스체망, 전기영동장치

전원공급장치, 라이트박스, 염색통(DNA Staining Box), 마이크로피펫, 피펫팁, Micro tube 1.5mL

Ⅳ. 실험과정

<브로콜리 DNA 추출과정>

1. 소금 2g에 계면활성제 7ml를 넣고 물을 150ml 부어서 소금-활성제액을 만든다.

2. 브로콜리 50g을 막자사발 안에 넣고 칼 혹은 가위로 잘게 자른다.

3. 작은 조각의 샘플을 막자사발에 넣고 막자로 아주 잘게 간다.

4. 소금-활성제액 100ml를 막자사발에 넣고 약 10분 동안 조심스럽게 섞으면서 갈아준다.

5. 구멍이 작은 체를 이용하여 용액을 걸러 찌꺼기를 제거한다.

6. 나무젓가락을 비커 벽에 대고 조심하면서 에탄올이 나무젓가락을 타고 내려가게 하면서 조심스럽게 에탄올을 비커에 넣는다. (에탄올은 세포 추출액 부피의 2배를 넣어준다.)

7. 흰색의 가는 선 모양의 물질이 생기면 먼저 돋보기로 관찰한 후 나무젓가락으로 여러 번 휘감아 올린다. 흰 색깔의 물질이 DNA가 엉켜서 생긴 것이다.

1. e-tube에 Proteinase K(or DNAzol) 200ul를 붓고, 추출한 브로콜리 DNA를 넣어 잘 녹인다, 이때 손으로 튜브를 잡고 흔들어 주면서 DNA가 에 잘 섞이도록한다.

(단백질 분해과정) 10000 x g의 속도로 10분간 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 새로운 튜브에 옮겨 담는다. (상층액에 DNA가 있다.)

2. 1%가 되게 아가로즈를 TAE Buffer에 넣고, CarolinaBlu™ DNA Stain을 비율에 맞게 넣고, 전자레인지에서 녹인 후 콤이 꽂아진 겔 틀에 붓고 겔이 굳을 때까지 기다린다. (간편하게 Pre-made Agarose gel을 이용해도 된다.)

3. 굳은 겔(or Pre-made Agarose gel)을 전기영동장치에 넣고 겔의 홈이 잠길 때까지 0.5X(or 1X) TAE buffer 를 붓는다.

4. Gel-well에 DNA 용액(약 12㎕)과 Gel loading buffer(3㎕)를 주입하고, 전원을 켜고 DNA를 “-”에서 “+”방향으로 이동시킨다.

5. 약 30분 정도 지나면 전원을 끄고, 겔을 전기영동장치에서 빼내 염색통(Staining Box)에 넣고 염색을 한다.(증류수 100ml 당 염색액 10~20㎕ 정도 넣는다)

6. 염색약으로 CarolinaBlu™ DNA Final Stain을 이용하여 약 15~20분 동안 DNA를 염색한다.

7. 염색이 끝난 Gel을 증류수에 넣고, 탈색시킨 후 미니 라이트박스에 올려놓고 관찰한다. (탈색: 증류수를 10분에 한 번씩 갈아주며 약 2회 실시한다.)

<실험 시 주의사항>

1. 소금-활성제액은 실험 전에 만들어 써야 효과가 좋다.

2. 실험재료는 반드시 신선하게 유지해야 유전물질의 파괴를 막을 수 있다.

3. 잘게 부순 브로콜리 용액에 나무젓가락을 비스듬하게 세운 뒤 에탄올을 막대를 따라 천천히 넣는다.

4. 전기영동 기구를 사용할 때 높은 전압이 걸리므로 전기 안전에 유의한다.

Ⅴ. 실험결과 및 토의

1. 전기영동 결과를 첨부하고 설명하여 보자.

2. 각자 제작한 DNA의 모형은 각각 DNA의 이중 나선 구조를 정확하게 나타내는가? 그렇지 못하다면 DNA의 어떤 특성을 제대로 나타내지 못하였는가?

3. 소금, 계면활성제, 에탄올의 역할은 무엇인가?

4. 브로콜리 DNA 추출 실험에서 무색의 DNA가 흰색으로 보이는 이유는?

5. 왓슨과 크릭이 발견한 DNA의 이중나선구조 이외에도 다른 형태의 DNA 구조가 있는지 알아보자.

6. tuberculosis 박테리아는 폐결핵을 일으킨다. 이 박테리아는 DNA의 염기의 15.1%가 아데닌으로 이루어져있다면 이 DNA에는 다른 염기가 각각 몇 %씩 있겠는가?

Ⅵ. 참고자료

1. DNA 추출 과정

DNA를 뽑는데 이용한 재료로는 주변에 구입과 보관이 쉬운 바나나, 키위 혹은 브로콜리를 이용하였다. 이들 재료는 가능하면 신선한 것을 이용하였으며, 키위나 브로콜리는 신도를 유지하기 위하여 사용 전까지 냉장 보관하기도 하였다. 이들 재료를 막자사발에 넣은 다음 갈아주고 DNA 추출을 도와주는 소금-활성제액을 넣어주었다. 소금-활성제액은 소금 2g에 계면활성제 7ml를 넣고 물을 150ml 부어서 만든 것이다. 이 용액은 실험 시작 전에 바로 만들어 놓고 다음 단계의 실험들을 진행하였다. 계면활성제는 세포막의 주성분인 인지질을 녹이는데 도움을 준다. 그리고 소금의 경우는 알콜을 넣어줬을 때 DNA가 잘 뭉치게 도와주며, 또한 무색인 DNA가 Na+ 이온과 결합하여 흰색을 띄게 한다.

2. 에탄올에 의한 DNA 침전 및 염색약의 염색 원리

DNA는 인산에 의해 ‘-’ 이온을 띠고 있는데 물은 극성을 띠고 있어 DNA 분자와 결합할 수 있기 때문에 물에 녹지만, 에탄올은 무극성 용액이기 때문에 DNA에 붙을 수 없어 DNA와 에탄올은 따로 존재하게 됨으로써 DNA가 침전된다.

반대로 에탄올을 제거한 침전된 DNA는 증류수나 완충용액(예: TE buffer)을 넣으면 녹는다. 따라서 나무젓가락에 감겨진 DNA를 증류수가 들어 있는 곳에 넣으면 증류수에 녹아 보이지 않는다.

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